Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева. Задания



Дата24.07.2016
өлшемі66.5 Kb.
#219828
Дрожжи.
Цель занятия изучить культуральные и морфологические признаки дрожжей; освоить методы микроскопической оценки дрожжей; подсчета микробных клеток дрожжей в счетной камере Горяева.

Задания:

1) приготовить препараты «раздавленная капля» чистых культур различных физиологических рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae и аспорогннных дрожжей;

2) изучить морфологию отдельных видов дрожжей;

3) определить содержание гликогена и метахроматина в дрожжевых клетках;

4) подсчитать количество нежизнеспособных дрожжевых клеток в исследуемой суспензии;

5) подсчитать количество дрожжевых клеток в исследуемой суспензии с помощью счетной камеры Горяева.

Препараты «раздавленная капля» просматривают с объективом 8Х и 40Х.

Оборудование и материалы: предмет­ные и покровные стекла; камера Горяева, специальное отшлифованное покровное стекло, пипетки (микро пипетка и на 1 см3), раствор с массовой долей серной кислоты 5%, раствор метиленового синего по Леффлеру, раствор Люголя, кристаллизатор с водой, раствор фуксина или метиленового синего для простого окрашивания, метиленовый синий в разведении 1 : 40, бензин, набор красок, раствор йода, иммерсион­ное масло, бактериальные петли, пастеровские пипетки, микроскопы, бактериологические петли, препаровальные иглы, марлевые салфетки, суточные культуры дрожжей Candi­da, Torulopsis, Hausenula, Saccharomyces.
Теоретические сведения.
По современным представлениям в группу дрожжей объединяют одноклеточ­ные микроскопические организмы, относящиеся к разным классам грибов, не образующие истинного мицелия, имеющие размеры в поперечнике 3-5 мкм, по длине – 10-15 мкм. Они встречаются среди различных классов высших гри­бов: аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных гри­бов. Растут дрожжи на средах с кислым рН и образуют колонии мягкой консистенции, не врастающие в субстрат. Форма и цвет колоний различаются у разных видов дрожжей. Дрожжевые клетки могут иметь: округлую, овальную, яйцевидную, цилиндрическую, апикулятную или лимоновидную форму (рис. 33).

Структура клеток (рис. 34) более сложная, чем у бактерий, включает оболочку, цитоплазму, диф­ференцированное ядро и другие фрагменты. Оболочка дрож­жей легко просматривается в обычном световом микро­скопе. Содержимое клеток дрожжей на ранней стадии роста однородно, затем в центральной части появля­ются многочисленные вакуоли и гранулы. Форма вакуо­лей изменяется в зависимости от условий культивирования и возраста культуры: в молодых клетках дрожжей вакуо­ли обычно соответствуют форме клетки, в зрелых они несколько сдавлены, а в отмирающих клетках могут быть сморщены и сжаты в результате нарушения взаимодейст­вия коллоидов внутри клетки.

В клетках дрожжей накапливается большое количест­во запасных питательных веществ: гликоген (вещество типа крахмала), капельки жира, а в вакуолях—волютин (метахроматин), основным компонентом которого являются полифос­фаты.

Размножаются дрожжи вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты), так называемые «культурные» дрожжи; к делящимся – виды рода Shizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При почковании на по­верхности клетки образуется один или несколько бугор­ков — почек, которые постепенно увеличиваются. Почки растут, пока не достигнут размеров материнской клетки, после чего происходит деление ядер. В почку из мате­ринской клетки переходит часть протоплазмы и элемен­ты ядра, после чего между двумя клетками образуется поперечная перегородка и почка отшнуровывается. Иног­да почки, еще не отделившиеся, начинают почкование, образуя скопление дрожжевых клеток (рис. 35).

При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. Спорообразование может наступить после многократного размножения путем почкования. Обычно спорообразование наблюдается при истощении питатель­ной среды и хорошей аэрации. Если такие дрожжи выра­щивать в постоянно обновляемой среде или с частыми пересевами, то клетки их все время могут сохраняться в вегетативном состоянии и размножаться только почко­ванием. Но достаточно перенести такие дрожжи в среду, бедную питательными субстратами, как большинство кле­ток переходит к спорообразованию. В одной клетке образуется 2 - 4, а иногда 8 - 12 спор. Клетка при этом рас­сматривается как аск (сумка), а споры — как аскоспоры.

К почкующимся дрожжам относятся представители рода Saccharomyces (сахаромицеты).

Споры дрожжей имеют толстые оболочки и довольно устойчивы к неблагоприятным воздействиям, но в ме­ньшей степени, чем эндоспоры бактерий (быстро погибают при температуре 60 °С). Таким образом, обра­зование спор у дрожжей — это одновременно процесс размножения и формирования устойчивых форм.

Некоторые виды дрожжей размножаются так же, как и бактерии, бинарным делением путем образования од­ной или нескольких поперечных перегородок. Такой спо­соб размножения наблюда­ется, например, у представи­телей рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицетов). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род является исключением, отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, образуя споры что характерно для сумчатых грибов. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces.

Дрожжи способны раз­лагать различные сахара. Поэтому они встречаются там, где происходит выделе­ние богатых сахаром соков: на фруктах, листьях, в нектаре цветов. В практической деятельности человека они издавна используются для получения хлеба, вина, пива, спирта, входят в состав кефирных грибков для производства кефира.

В настоящее время в промышленности применяют различные виды дрожжей: наибольшее значение имеют культурные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обозначают римскими цифрами (XII, XI и т.д.) или заглавной буквой, соответствующей первой букве названия расы: М – минская, Я – Якубовского и т.д. Определенные физиологические расы Saccharomyces ce­revisiae используют в соответствии с их биологической активностью в различных отраслях пищевой промышленности.

Класс несовершенных грибов объединяет аспорогенные, (ложные) дрожжи, неспособные к половому размно­жению и образованию спор. К ним относятся представители рода Candida, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Pullularia и др. На твердых питательных средах такие организмы так же, как и сахаромицеты, образуют колонии раз­личной консистенции. Несовершенные дрожжи имеют более характерную форму, отличающую их от других видов: стреловидную, треугольную, серповидную или колбовидную. Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовывать длинные клетки псевдомицелия. Они представляют собой довольно крупные одноклеточные организмы, в среднем 5 – 9 х 7 – 12 мкм, не образуют истинного мицелия, но могут вытягиваться в длину, сое­диняясь в цепочки. Такие образования называют псевдо­мицелием. Размножаются только почко­ванием, довольно широко распрост­ранены в природе. Они встречаются в различных водое­мах, в почвах, на растениях, продуктах питания, в орга­низме человека и животных. Некоторые виды Candida вызывают заболевание, называемое кандидозом, в биотехнологии используются для получения кормового белка при вы­ращивании их на промышленных отходах (например, уг­леводородах), для получения некоторых аминокислот (Candida utilis для получения триптофана), витаминов (Candida guilliermondii для получения витамина В2 – рибофлавина).

Широко распространенными являются также дрожжи рода Torulopsis, различные их виды используются в производстве сбраживаемых напитков типа кумыса, но вызывают болез­ни пива и некоторых других продуктов, получаемых путем броже­ния. Эти болезни проявляются в потере аромата, появле­нии неприятного запаха или ослизнения.


Методические указания к выполнению работы

Морфологические признаки дрожжей изучают просматривая препараты « раздавленная капля» с сухими объективами (8х, 40х) .

Определение гликогенаполисахарид, животный крахмал содержится в клетке у эукариот и прокариот в виде включений (веществ, возникающих в результате метаболизма клетки). Служит в качестве запасного материала и при недостатке углеводов в питательной среде используется клеткой. Гликоген окрашивается йодом в бурый цвет.

Для обнаруже­ния гликогена используют крепкий раствор йода в йодистом калии (7 г йода + 20 г йодистого калия + 100 см3 воды). На пред­метное стекло наносят небольшую каплю раствора йода и размеши­вают в ней петлей такую же каплю жидкой культуры дрожжей. На пре­парат накладывают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и через 2—3 мин микроскопируют. Наличие в цитоплазме бурых зернышек или крапинок указывает на присутствие гликогена. Пе­ред обработкой раствором йода рекомендуется обезжи­ривать препарат путем фиксирования в смеси спирта с эфиром (1 : 2). Это делается для того, чтобы удалить из клетки жир, который тоже отчасти окрашивается йодом. При подогревании окрашенного йодом препарата до 60° С красно-бурая окраска гликогена исчезает, а после охлаждения восстанавливается. Иногда гликогену может быть примешана гранулеза, и при слабом рас­творе йода получается синее окрашивание, при креп­ком — красно-бурое. На препарате сахаромицетов много почкующихся клеток. Поскольку гликоген активно расходуется в процессе метаболизма, то его можно обнаружить только в материнских клетках. В зависимости от количества накопленного углевода их цвет может меняться от ярко-желтого до бурого. В растущих клетках (почках) гликоген как правило не обнаруживается.



Обнаружение волютина (метахроматиновые зерна). Некоторые бактерии и дрожжи содержат в цитоплазме клетки вещество, со­стоящее из неорганических полифосфатов, запасное фосфор- и азотосодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты, получившее название волютин. В дрожжевой клетке при состоянии покоя волютин можно обнаружить в виде большой круглой капли внутри вакуоли. При со­стоянии активного обмена волютин в клетках распола­гается мелкими каплями по стенкам вакуоли или непо­средственно под клеточной стенкой. В большом количе­стве волютин накапливается у дрожжей перед почкованием. Накоп­ление волютина особенно интенсивно происходит при выращивании дрожжей на средах, богатых фосфатами.

Для обнаружения волютина в дрожжах используют расу XII дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на твердой питательной среде. Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На предметное стекло наносят каплю воды, петлей в форме замкнутого кольца вносят в неё культуру дрожжей, распределяют равномерно и круговыми движениями делают тонкий мазок на площади 1 – 2 см2. Препарат высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и окрашивают метиленовым синим по Лёфлеру (1,5 – 2 мин), после чего смывают краситель водой и обрабатывают препарат раствором серной кислоты с массовой долей 5 % в течение 5 – 7 сек. Кислоту смывают водой, препарат высушивают и просматривают с иммерсионным объективом. Цитоплазма дрожжевых клеток при этом окрашивается в голубой цвет, а гранулы полифосфатов – в синий. Можно окрашивать фиксированные препараты 20-30 с карболовым фуксином Циля. Через 0,5-1,0 мин промыть препарат водой, обесцветить 20-30 с раствором Н2SO4 с массовой долей 1%, промыть, дополнительно окрасить 20-30 с метиленовым синим (1 : 40), промыть, промокнуть, просмотреть с иммерсионной системой. Гранулы волютина приобретают красный цвет, цитоплазма – синий.



Определение процентного содержания нежизнеспособных клеток. На предметном стекле смешивают каплю суспензии дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII, выращенной на неохмеленном пивном сусле, смеши­вают с каплей метиленового синего. В препарате просматривают 10 полей зрения. Мертвые клетки окрашены в нем в синий цвет, живые остаются бесцветными. Определяют процентное со­держание нежизнеспособных клеток по отношению к общему числу клеток, наблюдаемых в поле зрения. Активные культуры дрожжей, используемые для засева, содержат не более 5 % мертвых клеток.

Определение способности дрожжей к размно­жению. Количество почкующихся клеток характеризует спо­собность дрожжей к размножению: активные дрожжи содержат 40—70 % клеток с почками. Из дрожжевой суспензии готовят препарат «раздавленная капля» и определяют процентное содержание почкующихся клеток по отношению к суммарному количеству дрожжей с почками и без них.

Подсчет количества клеток в счетной камере. Для подсчета клеток крупных бактерий, дрожжей, конидий плесневых грибов применяют различные счетные камеры, из которых наиболее часто используют камеру Горяева (рис. 39). Она представляет собой толстое предметное стекло, разделенное глубокими бороздками на поперечные площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена попо­лам. На каждой ее части нанесена сетка. Боковые площадки расположены на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла.

Сетка камеры Горяева разделена на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 квадратов в ряду). Площадь большого квадрата равна 1/25 мм2 и разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадрата равна 1/20 мм, площадь – 1/400 мм2. Часть больших квадратов разграфлена вертикально, горизонтально или не разграфлена.

Камеру и специальное шлифованное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят не­большую каплю исследуемой суспензии, накрывают шлифованным стеклом и притирают покровное стекло к боковым площадкам. Жидкость под покровным стеклом должна растекаться по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для того чтобы объем жидкости точно соответствовал расчетному объему камеры, покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления цветных колец (можно вначале притереть стекло, а потом из пипетки осторожно заполнить камеру). Под­счет клеток рекомендуется производить через 3—5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и распо­ложились в одной плоскости. Подвижные формы микроорганизмов перед нанесением на сетку следует убить нагреванием или добавлением 0,5 % формалина.

Камеру помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают с объективом 8Х или 40X (в зависимости от размеров клеток изучаемого объекта). Для получения достоверных результатов подсчет следует про­водить в 5 больших или 20 малых квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре в трех препаратах. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата; клетки, расположенные вне квадрата, не учитывают.

Количество клеток в 1 мл исходной суспензии:

,
где С – число клеток в 1 мл суспензии;

а – среднее число клеток в квадрате сетки;

h – глубина камеры, мм;

Sплощадь квадрата сетки, мм2;

n – степень разведения исходной суспензии;

1000 мм3 = 1 мл.



Контрольные вопросы.


  1. К каким группам грибов относятся дрожжи?

  2. Назовите физиологические признаки дрожжей. Где используются дрожжи?

  3. Опишите форму клеток дрожжей и способы их размножения.

  4. Дайте характеристику аспорогенных дрожжей.

  5. Какие включения клеток дрожжей Вы знаете?

  6. Как обнаруживается волютин в дрожжах?

  7. Как определить способность дрожжей к размножению?

  8. Как обнаружить гликоген в клетках дрожжей?

  9. Каким методом можно определить количество дрожжей в 1мм суспензии?





Достарыңызбен бөлісу:




©www.dereksiz.org 2024
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет